Application of phenazine pigment of Pseudomonas

aeruginosa isolates to prepare colored paper and candle

Maliheh Najafi¹, Mahboobeh Nakhaei Moghaddam^2*, Mahboobeh Najafi¹,

Ehsan Yousefi²

1. Department of Biology, Faculty of Science, Damghan Branch, Islamic Azad University, Damghan, Iran

2. Department of Biology, Faculty of Science, Mashhad Branch, Islamic Azad University, Mashhad, Iran

Abstract

Aim and Background: Microorganisms are more important than other sources in dye production because microorganisms have advantages such as rapid growth, higher yields, and easier extraction. Natural pigments are healthier than chemical types and their use is useful in various industries. The aim of this study was to isolate and extract the pyocyanin pigment from Pseudomonas aeruginosa isolates in order to preparation of colored paper and candle.

Material and Methods: In this study, sampling was performed from different hospital environments in order to isolate P. aeruginosa. Environmental isolates of P. aeruginosa were identified using morphological features and differential biochemical methods. Confirmatory identification was performed by tracing the pbo1 gene using colony PCR. After extracting pyocyanin pigment with chloroform, finally, the produced pyocyanin was used to prepare colored paper and candle and the optical stability of pyocyanin was investigated.

Results: From 43 environmental samples collected, 15 isolates of P. aeruginosa were identified and confirmed by molecular method. The mean of optical absorption (OD₅₂₀) of pyocyanin after extraction was 0.488. Staining of paper and candle with the extracted pyocyanin was successful and the optical stability of pyocyanin was favorable.

Conclusion: Due to the rapid growth of bacteria and the possibility of its mass production in a short time and based on the results of this study, bacterial pigments can be used in various industries, including paper industry, and replaced by chemical dyes.

Keywords: Pseudomonas aeruginosa, Phenazine, pbo1 gene, Iau Science.

مقدمه

شکل 2. رشد یکی از ایزوله­های سودوموناس آئروجینوزا در محیط ستریماید آگار

شناسایی مولکولی سودوموناس آئروجینوزا

جهت تأیید باکتری­های سودوموناس آئروجینوزای جدا شده از نمونه­های محیطی و ردیابی ژن تولید پیگمان از روش کلنی PCR و آغازگرهای ژن pbo1 (Sinaclon, Iran) مطابق با جدول 1 استفاده شد. با استفاده از نرم­افزارهای بیوانفورماتیکی و داده­های موجود در پایگاه NCBI استخراج توالی دقیق ژن pbo1 صورت پذیرفت. ابتدا توالی کامل ژن pbo1 براساس سایت، http://www.ncbi.nim.nih.yov (سودوموناس آئروجینوزا PAO₁ و Accession no=AF005404) در نظر گرفته شد و سپس با نرم­افزار oligo 7 پرایمرهای مناسب برای تکثیر بخشی از ژن­ها طراحی شدند. جهت اطمینان از صحت توالی­های استخراج شده، ارزیابی آن­ها با استفاده از جعبه ابزار BlastN در پایگاه NCBI انجام شد.

جدول 1. مشخصات آغازگرهای مورد استفاده برای ردیابی ژن pbo1 در ایزوله­های سودوموناس آئروجینوزای جدا شده از نمونه­های محیطی

مخلوط واکنش کلنی PCR برای تکثیر ژن­ pbo1 در حجم نهایی 25 میکرولیتر حاوی 5/0 میکرولیتر dNTPs (mM 2/0)، 75/0 میکرولیتر منیزیم کلرید (mM 2/0)، 1 میکرولیتر از هر یک از آغازگرهای پیشرو و پیرو (Pmol/μl 5/2)، 25/0 میکرولیتر Taq پلی­مراز ( unit/μl2/1) (Sinaclon, Iran)، 3 میکرولیتر بافر واکنش­گر (X 1)، 1 کلنی از باکتری و 5/17 میکرولیتر آب مقطر آماده شد. کلنی PCR توسط ترموسایکلر (Kyratec, Kore) و مطابق با چرخه­های دمایی زیر انجام شد: واسرشت اولیه در دمای C°95 به­مدت 5 دقیقه، واسرشت ثانویه در دمای C°95 به­مدت 1 دقیقه در 30 چرخه، اتصال در دمای C°58 به­مدت 1 دقیقه، بسپارش در دمای C°72 به­مدت 30 ثانیه و بسپارش نهایی در دمای C°72 به­مدت 7 دقیقه. محصول­های واکنش بر روی ژل آگارز 5/1 درصد حاوی اتیدیوم بروماید (CinnaGen, Iran) به­مدت 30 دقیقه با ولتاژ 90 ولت الکتروفورز (Interlab, Italy) شدند. سپس نمونه­های رانده شده در ژل توسط دستگاه فرابنفش لومیناتور (Caution, EEC) مشاهده و در نهایت از باندها با استفاده از دستگاه ژل داک (Kimiagene, Iran) عکس گرفته شد (16). از سودوموناس آئروجینوزا با شماره استاندارد ATCC 1074 (تهیه شده از سازمان پژوهش­های علمی و صنعتی ایران) به عنوان کنترل مثبت و از آب مقطر به عنوان کنترل منفی استفاده شد.

استخراج پیوسیانین سودوموناس آئروجینوزا

مقدار 250 میکرولیتر سوسپانسیون سودوموناس آئروجینوزا (01/0OD₆₂₀ =) رشد یافته در محیط لوریا برتانی (LB, Merck, Germany) به 25 میلی­لیتر محیط گلیسرول آلانین (GA, Merck, Germany) تلقیح و به­مدت 24 ساعت در انکوباتور شیکردار (دمای C°37) با سرعت rpm 200 گرماگذاری شد. در مرحله بعد، نمونه­ها با سرعت rpm 10000 به­مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ (Sigma, USA) شدند. مایع رویی جمع­آوری و از فیلتر با قطر منافذ 22/0 میکرومتر عبور داده شد. به 5/7 میکرولیتر از مایع رویی فیلتر شده، مقدار 5/4 میلی­لیتر کلروفرم اضافه و 10 مرتبه، هر مرتبه به­مدت 2 ثانیه ورتکس شد. این مرحله برای هر ایزوله 3 بار تکرار شد. کلروفرم در ته لوله قرار می­گیرد و به­علت اینکه پیوسیانین در کلروفرم حل می­شود، به آبی متمایل به سبز تغییر رنگ می­دهد. سانتریفیوژ نمونه­ها پس از تغییر رنگ با سرعت rpm 10000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد. مقدار 3 میلی­لیتر از لایه آبی رنگ جمع شده در ته لوله (مخلوط کلروفرم و پیوسیانین) به لوله جدید منتقل و به­منظور اسیدی شدن مخلوط، مقدار 5/1 میلی­لیتر اسید کلریدریک 2/0 مولار به آن اضافه و ورتکس شد (تغییر رنگ آبی به صورتی). سپس، نمونه­ها با سرعت rpm 10000 به­مدت 2 دقیقه سانتریفیوژ و مقدار 1 میلی­لیتر از مایع صورتی رنگ به کووت منتقل و جذب آن در طول موج 520 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد. این آزمایش به طور مشابه، برای تمامی ایزوله­ها و سویه استاندارد سودوموناس آئروجینوزا ATCC 1074، 3 بار تکرار شد. در نهایت غلظت پیوسیانین با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد (17).

5/1 × 072/17 × OD_{520 =} غلظت پیوسیانین (میکروگرم در میلی­لیتر)

تهیه کاغذ و شمع رنگی با استفاده از پیگمان پیوسیانین استخراج شده

از پیوسیانین تولید شده در محیط GA برای تهیه کاغذ و شمع رنگی استفاده شد. برای این منظور از ایزوله­های با ظرفیت بالاتر پیگمان استفاده شد. رنگ با استفاده از حلال کلروفرم استخراج و به منظور تغلیظ، 24 ساعت در انکوباتور C°37 گذاشته شد. از 25 میلی­لیتر محیط GA که سودوموناس آئروجینوزا در آن تولید پیگمان پیوسیانین کرده بود، 18 میلی­لیتر محلول رنگ جدا شد که 4 میلی­لیتر از آن برای رنگ­آمیزی کاغذ مورد استفاده قرار گرفت. به این صورت که کاغذ در بشر حاوی محلول قرار داده شد و بعد از 10 دقیقه، کاغذ از بشر خارج و در دمای محیط خشک شد. از لایه آبی شده به پارافین مذاب اضافه گردید. بعد از مدتی پارافین در دمای اتاق می­بندد و یک شمع با رنگ پیگمان باکتری تهیه می­شود. 

بررسی ثبات نوری پیگمان

ثبات نوری کاغذ رنگ­آمیزی شده مطابق استاندارد ISO 105/B02 توسط دستگاه ثبات نوری (Ress Sanj, Iran) اندازه­گیری شد (18).

یافته ها

جداسازی و شناسایی بیوشیمیایی ایزوله های سودوموناس آئروجینوزا از نمونه­های محیطی و ردیابی ژن مولد پیگمان 

بر اساس نتایج آزمون­های بیوشیمیایی در جدول 2، تعداد 15 ایزوله سودوموناس آئروجینوزا از نمونه­های محیطی جمع­آوری شد.

جدول 2. نتایج آزمون­های بیوشیمیایی جهت تشخیص سودوموناس آئروجینوزا

نتایج کلنی PCR وجود ژن pbo1 را در تمامی 15 ایزوله سودوموناس آئروجینوزای جدا شده تایید کرد. در شکل 3، ژل الکتروفورز محصول کلنی PCR تعدادی از ایزوله­ ها در کنار نشانگر 50 جفت­بازی نشان داده شده است.

استخراج پیوسیانین سودوموناس آئروجینوزا

پیوسیانین سودوموناس آئروجینوزا بعد از استخراج در شکل 4 نشان داده شده است. میانگین جذب نوری پیوسیانین سودوموناس آئروجینوزا بعد از استخراج با 3 تکرار در جدول 3 آمده است.

همان­طوری که در جدول 5 مشخص است، در میان ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا، ایزوله 2 و 11 بیش­ترین میزان تولید پیوسیانین و ایزوله 10 کم­ترین مقدار تولید پیگمان را بر اساس جذب نوری در طول موج nm520 داشتند.

شکل 3. ژل الکتروفورز محصول کلنی PCR  بعد از تکثیر ژن pbo1 تعدادی از ایزوله­های سودوموناس آئروجینوزا (1-4: نمونه­ها)

شکل 4. پیوسیانین سودوموناس آئروجینوزا بعد از استخراج

جدول3. جذب نوری (OD₅₂₀) پیوسیانین استخراج شده از ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا

رنگ­آمیزی کاغذ و تهیه شمع با پیگمان پیوسیانین و بررسی ثبات نوری پیوسیانین

شکل 5، کاغذها و شمع رنگ­آمیزی شده با پیگمان پیوسیانین تولید شده توسط ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا را نشان می­دهد. ثبات رنگ کاغذ بعد از رنگ­آمیزی با پیوسیانین مطلوب تعیین شد.

شکل 5. کاغذها و شمع رنگ­آمیزی شده با پیگمان پیوسیانین

بحث

پیگمان­ها ﺑﻪ­طور وسیعی در تهیه ﻏﺬا، ﭘﻮﺷﺎک، اسباب بازی کودکان، رﻧﮕ­ﺮزی و صنایع دیگر ﺑﻪ­کار می­رود. به این دﻟﻴﻞ که رﻧﮓدﻫﻨﺪهﻫﺎی ﺷﻴﻤﻴﺎﻳﻲ مشکلاتی را برای انسان و محیط زیست اﻳﺠﺎد میﻛﻨﻨﺪ، ﺗﺤﻘﻴﻘﺎت متعددی ﺑﺮای دﺳﺘ­ﻴﺎﺑﻲ ﺑﻪ ﻣﺤﺼﻮل­های ﻣﻄﻤﺌﻦ و پیگمان­های ﻃﺒﻴﻌﻲ از ﻣﻨﺎﺑﻊ ﻃﺒﻴﻌﻲ انجام شده است. ﻣﺪاﻓﻌﺎن محیط زیست ﻣﻌﺘﻘﺪﻧﺪ ﻛﻪ رﻧﮓ­های طبیعی از ﻟﺤﺎظ ﻛﻴﻔﻲ دارای ﺟﺎﻳﮕﺎه ﺑﺎﻻﺗﺮی ﺑﻮده و ﺑﻪ­دﻟﻴﻞ ﻃﻴﻒ رﻧﮕﻲ ﮔﺴﺘﺮده­ای ﻛﻪ دارند، چشم­نوازتر هستند. هم­چنین، ﺳﺎزﮔﺎری اﻳﻦ دﺳﺘﻪ از رﻧﮓ­ها با ﻃﺒﻴﻌﺖ و ﻗﺎﺑﻠﻴﺖ تجزیه­پذیری آن­ها از اهمیت بالایی برخوردار است. رﻧﮓﻫﺎی ﻃﺒﻴﻌﻲ ﺑﻪ­دﻟﻴﻞ تنوع بالا و آسان بودن تولید مورد توجه قرار گرفته­اند (19). رﻧﮕﺪاﻧﻪﻫﺎی ﻣﻴﻜﺮوﺑﻲ ﺑﻪ­دلیل ﺳﺮﻋﺖ رﺷﺪ ﺑﺎﻻی ﻣﻴﻜﺮوب­ﻫﺎ و اﻣﻜﺎن ﺗﻮﻟﻴﺪ اﻧﺒﻮه اﻳﻦ رﻧﮕﺪاﻧﻪ­ﻫﺎ اهمیت دارند (5). در این رابطه بر آن شدیم تا تولید رنگ از ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا که تحقیقات در مورد جنبه کاربردی آن کم بود و رنگدانه تولیدی نیز رنگ زیبایی داشت، مورد مطالعه قرار دهیم. در همین رابطه، Nowroozi و همکاران گزارش کردند که سودوموناس­هایی که دارای ژن­های phzM و phzS هستند، قادر به تولید پیگمان پیوسیانین هستند (20). در این مطالعه، بر اساس آزمایش­های بیوشیمیایی و مولکولی (ردیابی ژن pbo1، ژن اپرون بیوسنتز پیوسیانین) تعداد 15 ایزوله سودوموناس آئروجینوزا از نمونه­های محیطی جدا و شناسایی شد. در مطالعه Higgins و همکاران در سال 2018، مشابه با تحقیق حاضر از ژن pbo (phz1 و phz₂) برای شناسایی سودوموناس آئروجینوزا استفاده کردند (14). در میان ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا، توانایی تولید پیگمان در ایزوله­های مختلف، بر اساس جذب نوری در طول موج nm 520، با یکدیگر و با سویه رفرنس متفاوت بود. Khan و همکاران در سال 2019، مشابه با تحقیق حاضر از سودوموناس آئروجینوزا PAO1 KCTC 1637 پیگمان پیوسیانین استخراج کردند (21). نتیجه رنگ­آمیزی کاغذ و شمع با پیوسیانین مطلوب و قابل قبول بود. میزان تولید پیگمان در ایزوله­های مختلف متفاوت بود که می­توان با شناسایی ایزوله­های با پتانسیل تولید بیش­تر و بهینه­سازی شرایط محیطی، میزان استخراج رنگ را افزایش داد. در تحقیق حاضر نیز، در میان ایزوله­های مختلف مورد آزمایش، میزان تولید پیگمان در ایزوله 2 بیش­تر از سایرین و سویه رفرنس بود که می تواند به عنوان سویه برتر برای تولید رنگ معرفی شود.

در مطالعه­های گذشته، پیشینه­ای در جهت تهیه کاغذ و شمع رنگی با پیگمان­های سودوموناس آئروجینوزا یافت نشد. مشابه با پژوهش حاضر، در مطالعاه­های گوناگون از پیگمان­های باکتریایی در صنایع مختلف از جمله رنگرزی لباس، صنایع غذایی و دارویی و محصول­های آرایشی به­عنوان رنگ­زا استفاده شده است (22،23). در تحقیق DeBritto و همکاران در سال 2020، پارچه­های پنبه­ای را با پیوسیانین استخراج شده از سودوموناس آئروجینوزا رنگ­آمیزی کردند که همانند تحقیق حاضر، ثبات رنگ تأیید شد (11). Jissa و همکاران در سال 2008 با استفاده از پیگمان تولید شده توسط گونه­های سراشیا اقدام به رنگ­آمیزی لاستیک، کاغذ، منسوجات و پلاستیک نمودند و بیان کردند که پیگمان استخراج شده خاصیت رنگرزی دارد و همانند تحقیق حاضر، ثبات رنگ با آزمایشات مربوطه تأیید شد (24). Heydari و همکاران در سال 1393، پتانسیل جذب پرتوی فرابنفش توسط رنگدانه جداسازی شده از قارچ‌های آسپرژیلوس و پنی­سیلیوم به­منظور استفاده در ترکیب­های ضد آفتاب را بررسی نمودند. نتایج به­دست آمده در این مطالعه نشان داد که پیگمان­های جداسازی شده از قارچ­های پنی­سیلیوم و آسپرژیلوس محافظت خوبی را در مقابل اشعه ماورای بنفش از خود نشان داده­اند. هم­چنین در زمینه بررسی تنوع رنگ، در بین گونه‌های قارچی مورد ارزیابی پیگمان­های زرد و مشکی بهترین جذب اشعه را دارا بودند. بنابراین می­توان از این پیگمان­های طبیعی به­جای ترکیب­های شیمیایی در کرم­های ضد آفتاب استفاده نمود (25). در تحقیق حاضر با استخراج پیوسیانین، کاغذ و شمع رنگ­آمیزی شد که مزایای استفاده از پیگمان باکتری­ها، رشد سریع، محیط کشت ارزان و تنوع رنگ در رنگدانه­ها است. محققین نشان داده­اند که پیگمان قارچ­هایی مثل پنی­سیلیوم و موناسکوس را می­توان استخراج نمود و در صنایع چرم، پارچه، کاغذ و رنگ استفاده کرد (26). سودوموناس آئروجینوزا توانایی تولید رنگدانه­های محلول در آب نظیر رنگدانه غیر فلوئورسنتی آبی رنگ یا پیوسیانین که محلول در آب و کلروفرم است، رنگدانه فلوئورسنتی سبز رنگ به نام پیوردین، رنگدانه فلوئورسنتی قرمز تیره پیوروبین و رنگدانه فلوئورسنتی سیاه پیوملانین را دارد. پیوسیانین رنگدانه اختصاصی سودوموناس است و می­توان آن را با کلروفرم از محلول­های آبی جدا کرد. اغلب این رنگدانه­ها دارای عملکردهای زیستی مهمی از جمله فعالیت آنتی­بیوتیکی، ضد قارچی و ضد توموری هستند (27). رنگ حاصله برخلاف باکتری مولد آن خاصیت بیماری­زایی نداشت، بلکه همان­طوری­که ذکر شد می­تواند خاصیت ضد میکروبی داشته باشد.

در سال­های اخیر توجه زیادی به پیگمان­های میکروارگانیسم­ها و مسیرهای بیوسنتز آن­ها شده است. میکروارگانیسم­هایی هم­چون قارچ­ها و باکتری­ها می­توانند یک منبع با ارزش برای تولید مواد رنگی باشند و با طیفی گسترده به­کار روند. تولید رنگ­های مصنوعی شاید از لحاظ اقتصادی مقرون­به صرفه باشد، اما رنگ­های مصنوعی با چالش­هایی از جمله وابستگی­به منابع نفتی غیرقابل احیا، سمیت محیطی، مسائل بهداشتی و عدم بازیافت رو به­رو هستند. در حالی­که رنگ­های طبیعی مصرف شده می­توانند بازیافت شده و هیچ بوی نامطبوعی ندارند. بنابراین جستجوی منابع طبیعی که از لحاظ زیست­محیطی هم سازگار باشند، برای تولید مواد رنگی یک نیاز ضروری است (28). در تحقیق حاضر با پیگمان طبیعی پیوسیانین کاغذ رنگ­آمیزی شد، ولی با تحقیقات بیش­تر برای تعیین ساختار پیگمان­ها و حذف گروه­های سمی پیگمان­ها می­توان از آن­ها در صنایع مختلف استفاده نمود. 

پیگمان­های طبیعی از دو منبع مهم گیاهان و میکروارگانیسم­ها حاصل می­شوند. تولید پیگمان از میکروارگانیسم­ها با توجه­به رشد سریع و آسان، محیط کشت ارزان، استخراج راحت­تر، عدم وابستگی­به شرایط جوی و گستردگی تنوع رنگ نسبت­به سایر منابع زیستی دارای مزایای بیش­تری است. بسته­به نوع ترکیب­ها، آن­ها عملکردهای متفاوت و متنوعی برای میزبان دارند. به­طور مثال عمل حفاظتی در برابر فتواکسیدان­های کشنده مثل کارتنوئید­ها و عملکرد حفاظتی در برابر استرس­های محیط مثل ملانین­ها را دارند و به­عنوان کوفاکتور در کاتالیز آنزیم­ها مثل فلاوین­ها شرکت دارند (29).

نتیجه­گیری

نتایج تحقیق حاضر نشان داد که ایزوله­های محیطی سودوموناس آئروجینوزا در تولید رنگ طبیعی کارآیی داشتند و رنگ تولیدی، از ثبات مطلوبی نیز برخوردار بود. رنگ حاصل، ضمن خوش رنگ بودن و سازگاری با محیط زیست، دارای منبع طبیعی و خطرهای کم­تری در مقایسه با رنگ­های شیمیایی است. ﺑﺎ ﺗﻮﺟﻪ­ﺑﻪ رﺷﺪ ﺳﺮﻳﻊ ﺑﺎﻛﺘﺮیﻫﺎ و اﻣﻜﺎن ﺗﻮﻟﻴﺪ اﻧﺒﻮه آن در ﻣﺪت زﻣﺎن ﻛﻮﺗﺎه و براساس نتایج تحقیق حاضر، ﻣﻲﺗﻮان از پیگمان­ پیوسیانین به­عنوان یک رنگ طبیعی برای رنگ­آمیزی کاغذ و شمع استفاده و آن­را جایگزین رنگ­های شیمیایی نمود. هم­چنین نتایج نشان داد که ردیابی ژن pbo در سودوموناس آئروجینوزا با روش کلنی PCR و پرایمر طراحی شده در این تحقیق، می­تواند باعث صرفه­جویی در وقت، مواد و هزینه شود و احتمال آلودگی حین کار را نیز کاهش می­دهد.

سپاسگزاری

نویسندگان مقاله بدین­وسیله مراتب تشکر و قدردانی خود را از مسئولین محترم دانشگاه آزاد اسلامی واحد مشهد جهت فراهم آوردن امکانات پژوهشی برای انجام این تحقیق ابراز می­دارند.